年，新加坡国立大学俞皓教授课题组在NatureCommunication上发表题为“Site-specificphosphorylationofTRANSPARENTTESTAGLABRA1mediatescarbonpartitioninginArabidopsisseeds”的研究论文，该研究不仅解析了拟南芥种子内碳分配的机制，也为蛋白互作的研究提供了范本。
研究背景
TTG1是一个WD40转录因子，其在拟南芥胚后发育和种子发育中发挥着重要的作用，现有研究发现TTG1是种子发育过程中调控碳分配的关键转录因子。已有研究发现TTG1可以跟MYB和bHLH转录因子互作形成复合体调控诸多发育过程，如通过调控PA生物合成通路的关键酶BANYULS进而影响种被，或是调控TTG1潜在下游靶基因GL2影响种子性状。由于尚未获得有关TTG1与其他蛋白互作或是调控下游靶基因的证据，TTG1调控种子发育的分子机制仍未被解析。
研究内容
1.确定蛋白间互作
本研究首先通过Pull-down（图1a），BiFC（图1b），Y2H（图1c）和CoIP（图1d）验证了TTG1与SK11和SK12互作。在Pull-down实验中InputMBP标签和MBP-TTG1融合蛋白可杂交到两个大小不同的条带，Pull-down后仅加了MBP-TTG1和GST-SK11或GST-SK12的有条带，所有Pull-down的结果均有GST证明，Pull-down实验均没有问题（图1a）。在BiFC实验中仅在TTG1-cYFP与nYFP-SK11或TTG1-cYFP与nYFP-SK12中检测到黄色荧光（图1b）。在Y2H实验中，所有菌在SD-Trp/-Leu上正常生长，在SD-Trp/-Leu/-His0.3mM3AT上仅AD-TTG1与BD-SK11或BD-SK12能长（图1c）。在CoIP实验中，WT和gh4HA-TTG1突变体中均瞬转了SK11:SK11Ek-GFP，故Input均为阳性，CoIP后WT无条带而gh4HA-TTG1有条带证明SK11与TTG1互作，IB：HA证明gh4HA-TTG1实验对照组正常（图1d）。
图1TTG1与SK11和SK12互作
2.互作蛋白编码基因表达模式
定量实时PCR分析显示SK11与SK12均在莲座叶和幼嫩的果荚中表达量较高，SK11在茎和开放的花中表达量与莲座叶相同，在花苞中的表达量只有莲座叶中的一半，在完全成熟的果荚中表达量最低（图2a），而SK12在上述组织中的表达量都明显降低，仅在幼嫩果荚中的表达量降低幅度较小（图2b），SK11/SK12的表达量都会随着授粉时间逐渐降低（图2c，d），且两者都在整个种子中表达，在授粉4天后在合点出高表达（图2e）。
Tips：合点：胚珠内珠心基部与珠被连合部分称合点，由胎座进入珠柄中的维管束经合点,通向胚珠内部。
图2SK11与SK12的表达模式
3.确定互作蛋白在同一生物过程发挥功能
然后，作者检测了SK11/SK12对种子性状的影响，发现SK11/SK12的缺失突变会使种子颜色变深（图3a）而脂肪含量降低（图3b）。SK11的过表达会使拟南芥种子颜色变浅（图3a）且脂肪含量升高（图3b），TTG1的缺失突变会使拟南芥种子外皮颜色变浅（图3a），脂肪含量增加（图3g），Bik处理会使野生型种子脂肪含量降低（图3g）且颜色加深（图3d），但TTG1和TT2的缺失突变体不会受到影响（图3g，e，f）。
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Tips：Bikinin：磷酸化抑制剂，ATP竞争性抑制剂，作为油菜素类固醇(BR)信号的一种强效活化剂发挥作用，抑制脱落酸信号输出，抑制植物体内激酶活性。
图3改变SKs的活性会影响种子特性
4.蛋白互作功能位点的精细分析
通过对TTG1不同磷酸化位点突变体的免疫印迹检测，作者发现SK11/SK12通过磷酸化TTG1上的Ser发挥作用（图4c，d）
图4SK11和SK12通过Ser磷酸化TTG1
作者设计了Ser磷酸化和去磷酸化突变，发现TTG1磷酸化会减弱拟南芥外种皮的颜色，增加种子的脂肪含量，而TTG1的去磷酸化会加深种子外皮的颜色，减少脂肪的含量（图5）。
图5Ser磷酸化后的TTG1失去了调控种子性状的活性
进一步研究发现Ser磷酸化后TTG1不能和TT2互作（图6）。
图6Ser磷酸化后的TTG1不能和TT2互作
5.蛋白互作对下游靶基因的影响
作者通过ChIP和EMSA验证了TTG1和TT2互作能结合GL2的启动子，而TTG1被磷酸化后不能和TT2互作进而难以结合GL2的启动子（图7）。
图7Ser磷酸化后的TTG1削弱了TTG1通过TT2结合GL2位点
最后，作者提出了整个通路的调控模型（图8）。
图8SK11/SK12通过磷酸化TTG1特殊位点调控拟南芥种子碳分配模型
评述
大佬在顶刊上的文章往往都是后生学习的典范，这一研究为蛋白互作机制的研究提供了一个非常具有参考价值的模板。全篇所有的研究都用了两个以上的证据证明结论，核心的互作研究更是把常规的四个技术全部囊括，文章在对照的选取上也非常严谨全面，非常值得参考学习。从本文，我们可以总结出蛋白互作功能研究的“五步法”套路：
1.确定蛋白间互作
2.互作蛋白编码基因表达模式
3.确定互作蛋白在同一生物过程发挥功能
4.蛋白互作功能位点的精细分析
5.蛋白互作对下游靶基因的影响
只要把握住这5个方面，小题大做，保证每一部分的证据质量，文章水平便有了保证。当然，大佬讲故事的水平也非常高超，全篇研究层层递进，抽丝剥茧般的阐明了整个调控机制，研究发现种被的颜色深浅竟然和脂肪酸的含量有关，最后提出的调控模式图也让人眼前一亮。
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本文编辑：佚名
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